潔凈室沉降菌測試標準操作規(guī)程

1目的：建立潔凈室中沉降菌的測試標準操作規(guī)程，保證藥品在規(guī)定潔凈內進行生產。
  2范圍：潔凈室的沉降菌的監(jiān)測。
  3依據：國家標準GB/T 16294-1996。
  4職責：QA潔凈度監(jiān)測人員、微生物檢驗人員對本制度的實施負責。
  5內容
  5.1潔凈室：對塵粒及微生物污染規(guī)定需進行環(huán)境控制的房間或區(qū)域。
  5.2潔凈工作臺：一種工作臺或者與之類似的一個封閉圍擋工作區(qū)。其特點是自身能夠供給經過過濾的空氣或氣體，如垂直層流潔凈罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺、水平層流潔凈工作臺、自凈器等。
  5.3潔凈度：潔凈環(huán)境內單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑懸浮粒子的允許統(tǒng)計數。
  5.4菌落：細菌培養(yǎng)后，由一個或幾個細菌繁殖而形成的一細菌集落，簡稱CFU。通常用個數表示。
  5.5測試方法
  5.5.1方法概述：本測試方法利用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經48小時以上培養(yǎng)，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落數，來評定潔凈環(huán)境內的活微生物數，并以此來評定潔凈室的潔凈度。
  5.5.2所用的儀器和設備
  5.5.2.1高壓消毒鍋：使用時參照文件G-L-SOP-066-00進行操作。
  5.5.2.2恒溫培養(yǎng)箱：必須定期對培養(yǎng)箱的溫度計進行檢定。
  5.5.2.3培養(yǎng)皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培養(yǎng)皿。使用前將培養(yǎng)皿置于121℃濕熱滅菌20分鐘。
  5.5.2.4培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至約45℃在無菌操作條
  件下將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15m1。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)基平皿放入30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數小時，若培養(yǎng)基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用，制備好的培養(yǎng)基平皿應在2～8℃的環(huán)境中存放。
  5.5.3測試步驟
  5.5.3.1采樣方法：將已制備好的培養(yǎng)皿放置在預先確定的取樣點，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5小時，再將培養(yǎng)皿蓋上蓋后倒置。
  5.5.3.2培養(yǎng)：全部采樣結束，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30～35℃培養(yǎng)，時間不少于48小時。每批培養(yǎng)基應有對照試驗，檢查培養(yǎng)基本身是否污染，可每批選定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。
  5.5.3.3菌落計數：用肉眼直接計數，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數。
  5.6注意事項
  4.6.1測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
  5.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。
  5.6.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數作詳細的記錄。
  5.6.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。
  5.6.5采樣前應仔細檢查每個培養(yǎng)皿的質量，如發(fā)現變質、破損或污染的應剔除。
  5.7測試規(guī)則
  5.7.1測試狀態(tài)
  5.7.1.1沉降菌測試前：被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達到規(guī)定的要求，靜壓差、必須控制在規(guī)定值內。被測試潔凈室（區(qū)）已消毒。
  5.7.1.2測試狀態(tài)有靜態(tài)和動態(tài)兩種，并在報告中注明測試狀態(tài)。
  5.7.1.3測試人員：測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度的工作服。靜態(tài)測試時，室內測試人員不得多于2個人。
  5.7.2測試時間
  5.7.2.1對單向流，如100級凈化房間內及層流工作臺，測試應在凈化空調系統(tǒng)正常運行不少于10分鐘后開始。
  5.7.2.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統(tǒng)正常運行不少于30分鐘開始。
  5.8沉降菌計數
  5.8.1少采樣點數目：可按表1確定。在滿足少測點數的同時，還宜滿足少培養(yǎng)皿數，見表2。
  表1 少采樣點數目
  面積（m2）  潔凈度
    100  10000  100000  300000
  ＜10  2～3  2  2  2
  ≥10～＜20  4  2  2  2
  ≥20～＜40  8  2  2  2
  ≥40～＜100  16  4  2  2
  ≥100～＜200  40  10  3  3
  注：表中的面積對于單向流潔凈室是指送風面積，對于非單向流潔凈室是指房間面積。
  表2 少培養(yǎng)皿數
  潔凈度  所需Φ90mm培養(yǎng)皿數（以沉降0.5小時計）
  100  14
  10000  2
  100000  2
  300000  2
  5.8.2采樣點的布置：工作區(qū)測試點位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）?？稍陉P鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點，采樣點的布置應力求均勻，避免采樣點在某
  局部區(qū)域過于集中，某局部區(qū)域過于稀疏。
  5.8.3記錄：測試報告中應記錄房間溫度、相對濕度、壓差、測試狀態(tài)及測試數據。
  5.8.4結果計算：用計數方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數。平均菌落數的計算見下式：
  m1+m2+……+mn
  平均菌落數m=n
  式中：m為平均菌落數；m1為1號培養(yǎng)皿菌落數；m2為2號培養(yǎng)皿菌落數；mn為n號培養(yǎng)皿菌落數；n為培養(yǎng)皿總數。
  5.8.5結果評定：用平均菌落數判斷潔凈室的空氣中的微生物。
  5.8.6潔凈室（區(qū)）內的平均菌落數必須低于所選定的評定標準（見表3）。
  5.8.7若某潔凈室（區(qū)）的平均菌落數過評定標準，則必須對此區(qū)域先行消毒，然后重新測試兩次，測試結果必須合格。
  表3
  潔凈  100級  10000級  100000級  300000級
  標準（平均）  1個/皿  3個/皿  10個/皿  15個/皿